微生物常見檢測方案

     微生物檢測常見的方法有：生長量測定法、微生物計數(shù)法、生理指標法和商業(yè)化快速微生物檢測等，本文列舉了一些常用檢測方法的的原理、應(yīng)用范圍和優(yōu)缺點。

      微生物生長意味著原生質(zhì)含量的增加，所以測定的方法也都直接或間接的以次為根據(jù)，而測定繁殖則都要建立在計數(shù)這一基礎(chǔ)上。微生物生長的衡量，可以從其重量，體積，密度，濃度，做指標來進行衡量。

一、生長量測定法

1、體積測量法：又稱測菌絲濃度法。

原理：通過測定一定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。菌絲濃度測定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的一個重要監(jiān)測指標。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設(shè)定一致的處理條件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營養(yǎng)物，結(jié)果會有一定偏差。

2、稱干重法：

原理：利用離心或過濾法測定。一般干重為濕重的10-20%。稱干重發(fā)法較為煩瑣，通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時，常采用這種方法，如活性干酵母（activity  dry  yeast, ADY）,一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。

3、比濁法：

原理：微生物的生長引起培養(yǎng)物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長監(jiān)測。

4、菌絲長度測量法：

方法：對于絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養(yǎng)基上測定一定時間內(nèi)菌絲生長的長度。

二、微生物計數(shù)法

1、血球計數(shù)板法:

這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜于單細胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進行計數(shù)，并且所得結(jié)果是包括死細胞在內(nèi)的總菌數(shù)。

2、染色計數(shù)法：

為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數(shù)，而直接用血球計數(shù)板法又無法區(qū)分死細胞和活細胞的不足，人們發(fā)明了染色計數(shù)法。

3、比例計數(shù)法：

將已知顆粒（如霉菌孢子或紅細胞）濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目，即可得未知菌液的細胞濃度。

4、液體稀釋法：

對未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋，根據(jù)估計數(shù)，從最適宜的三個連續(xù)的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15只裝培養(yǎng)液的試管中，經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù)，然后查最大或然數(shù)表MPN（most probably number）得出菌樣的含菌數(shù)，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物檢查。

5、平板菌落計數(shù)法：

這是一種常用的活菌計數(shù)法。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術(shù)。平板菌落計數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù)，而且同時將菌液中的細菌進行了一次分離培養(yǎng)，獲得了單克隆。

6、試劑紙法：

在平板計數(shù)法的基礎(chǔ)上，發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計數(shù)用。試劑紙法計數(shù)快捷準確，相比而言避免了平板計數(shù)法的人為操作誤差。

7、膜過濾法：

用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經(jīng)丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光，活細胞會發(fā)橙色熒光，而死細胞則發(fā)綠色熒光。

三、生理指標法

微生物的生長伴隨著一系列生理指標發(fā)生變化，例如酸堿度，發(fā)酵液中的含氮量，含糖量，產(chǎn)氣量等，與生長量相平行的生理指標很多，它們可作為生長測定的相對值。

1、測定含氮量：

大多數(shù)細菌的含氮量為干重的12.5%，酵母為7.5%，霉菌為6.0%。根據(jù)含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測氮氣法。

2、測定含碳量：

將少量（干重0.2-2.0 mg）生物材料混入1毫升水或無機緩沖液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 0C下加熱30分鐘后冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標準樣品做標準曲線。

3、還原糖測定法：

還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況，常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的常規(guī)監(jiān)測。

4、氨基氮的測定：

方法是，離心發(fā)酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02N的NaOH調(diào)色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應(yīng)數(shù)刻，加入0.02N的使之變色，根據(jù)NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據(jù)培養(yǎng)液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。

5、其他生理物質(zhì)的測定：

P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，產(chǎn)CO2（用標記葡萄糖做基質(zhì)），耗氧，黏度，產(chǎn)熱等指標， 都可用于生長量的測定。也可以根據(jù)反應(yīng)前后的基質(zhì)濃度變化，最終產(chǎn)氣量，微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。

四、商業(yè)化快速微生物檢測法

       微生物的檢測，其發(fā)展方向是快速，準確，簡便，自動化，當(dāng)前很多生物制品公司利用傳統(tǒng)微生物檢測原理，結(jié)合不同的檢測方法，設(shè)計了形式各異的微生物檢測儀器設(shè)備，正逐步廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微生物檢測和科學(xué)研究領(lǐng)域。這些儀器和設(shè)備的生產(chǎn)廠家很多，產(chǎn)品各異，在此不做一一介紹，具體可查看各公司的產(chǎn)品說明。